Diese Seiten sollen ueber Strategien der modernen Gentherapie und Immuntherapie aufklaeren. Desweiteren soll diese Homepage viele nuetzliche Elemente enthalten, die Wissenschaftlern eine leichte Recherche zu Arbeiten in diesem Bereich offeriert. In dem Methoden-Link stelle ich eine Menge Protokolle zur Verfuegung, die bei uns im Labor etabliert sind. In Zukunft soll dieser Bereich stark erweitert werden um so laestige Suche nach Versuchsprotokollen zu ersparen. Natuerlich stelle ich auch meine eigenen Arbeiten in diesem Rahmen vor, weitere Informationen zu diesen Themen sollen demnaechst auf der Homepage unseres Labors zu entnehmen sein. Leider sind die Webmaster an der Uni nicht so schnell, daher ist der Link zu der Uni-Bonn noch nicht aktiv.

Gentherapie bedeutet im allgemeinen die Einschleusung eines oder mehrerer Fremdgene in den Organismus mit therapeutischem Nutzen fuer das Individuum. Somatische Gentherapie hat zum Ziel, vererbte und erworbene Genkrankheiten, durch das Einbringen von normalen (gesunden) Genen in bestimmte Zielzellen des koerpers definitiv zu heilen. Das konzept der Gentherapie hat sich vor allem in Tiermodellen durchgesetzt. Fuer durchschlagende klinische Erfolge sind weitere Fortschritte in der molekularen Genetik und in den Methoden des gezielten in vivo Gentransfers notwendig (Targeting).

Abbildung1: Modalitaeten der somatischen Gentherapie

Anwendungsmoeglichkeiten der Gentherapie ergeben sich vor allem auf vier Gebieten, naemlich den klassischen Erbkrankheiten mit isoliertem Einzelgendefekt, den erworbenen genetischen Erkrankungen (z.B. chronische Infektionskrankheiten), den multifaktoriellen genetischen Erbkrankheiten (z.B. Herz- und Kreislaufkrankheiten) und Krebs.

Krebs ist heute allgemein als genetische Krankheit, die mit einer abnormalen proliferation von Zellklonen einhergeht, anerkannt. Der hohe Proliferationsindex macht Krebszellen zu einem idealen Ziel von verschiedenen Gentransfermethoden. Zudem offeriert die komplexe Biologie von Krebszellen ein breites Spektrum von gentherapeutischen Ansatzpunkten. Eine wichtige Voraussetzung fuer eine erfolgreiche Gentherapie ist jedoch die effiziente und reproduzierbare Einschleusung und Expression des gewuenschten Gens in die Zellen. In den meisten Faellen wird zur Zeit der Gentransfer ex vivo (siehe Abb.1) durchgefuehrt. Hierbei werden die Zielzellen aus dem Organismus isoliert, in Zellkultur mit dem therapeutischem / gesundem Gen transfiziert und schliesslich wieder in den Organismus reimplantiert. Die in vitro (siehe Abb.1) Gentransfermethoden sind generell effizienter als die zur Zeit zur Verfuegung stehenden ex vivo Methoden. Die Anwendbarkeit der ex vivo Gentherapie beschraenkt sich methodisch bedingt nur auf jene Zellen, die relativ leicht aus dem koerper isoliert und in ausreichenden Mengen gezuechtet weden koennen. Zudem gelingt die Reimplantation der in vitro transfizierten Zellen in den koerper oft nur unvollstaendig oder die Expression des Transgens geht in vivo relativ rasch verloren.

Methoden des Gentransfers:

Auflistung einiger verschiedener Ansaetze des Gentransfers:

Gentherapie ist vor allem abhaengig von der Entwicklung von sicheren und leicht anwendbaren in vivo Gentransfermethoden, welche eine effiziente und stabile Genexpression in bestimmten Zielorganen erlauben. Grundsaetzlich gibt es virale und nichtvirale Gentransfermethoden (siehe Tabelle). Virale Transfermethoden benutzen genetisch modifizierte Viren als Transportvehikel fuer genetisches Material. Am haeufigsten finden zur Zeit replikationsdefiziente Retro- und Adenoviren Verwendung. Retrovirale Vektoren haben den Vorteil, dass sie das gewuenschte Gen in das Genom von sich teilenden Zellen integrieren und damit zu einer stabilen Genexpression in Mutter- und Tochterzellen fuehren koennen. Bei der Verwendung von adenoviralen Vektoren koennen auch nicht proliferende Zellen effizient transfiziert werden, dabei wird das gewuenschte Gen jedoch nicht integriert und es kommt nur zu einer transienten Expression (weitere Vor + Nachteile siehe Tabelle). Stand der Forschung ist, dass eine Vielzahl von Viren auf ihr potentielles Nutzen fuer die Gentherapie untersucht und die Entwichklung neuartiger Vektorsysteme (z.B. Gutless Vektoren) vorangetrieben werden.

Zukunft mit Gentherapie ?

Das Konzept der Gentherapie ist ein voellig neuer Ansatz zur Therapie von Krankheiten, waehrend Arzneimittel lediglich abnormale Zellfunktionen voruebergehend modifizieren, hat die Gentherapie das Potential, viele Krankheiten definitiv zu heilen. Dazu muss jedoch noch viel grundlegende Entwicklungsarbeit geleistet werden. Zum Einsatz des in vivo Gentransfer muss zuerst ein ausreichendes Targeting der Vektoren erreicht werden. Die gaengigen Transfektionsmethoden muessen noch effizienter werden und das Ziel in ferner Zukunft ist der Genersatz der Defekten Gene durch homologe Rekombination.

Was versteht man unter "Immuntherapie"?

Unter Immuntherapie oder auch Immunmodulation versteht man die therapeutische Beeinflussung der Immunreaktion, d.h. der Abwehrbereitschaft des Organismus. Die Idee, die der Immuntherapie bei Krebserkrankungen zugrundeliegt, ist, die Aufmerksamkeit des Immunsystems gegenüber Krebszellen und damit die Abwehrreaktion so zu beeinflussen, daß der Tumor vom Körper selbst bekämpft wird.

Welche Formen der Immuntherapie bei Krebs gibt es?

Einige Ansätze der Immuntherapie bei bösartigen Tumoren beruhen auf der Verabreichung von Substanzen, die als Immunmodulatoren ("biological response modifiers") bezeichnet werden, was soviel bedeutet wie "Substanzen, die die Immunantwort beeinflussen". Es handelt sich dabei um dieselben Substanzen, mit denen sich die Abwehrzellen im Körper untereinander verständigen und aktivieren, sogenannte Botenstoffe oder auch Zytokine. Einige können bereits auf gentechnischem Wege hergestellt werden und sind somit für die Anwendung in reiner Form verfügbar, andere müssen aus Zellkulturen oder aus dem Blut gewonnen werden. Die bekanntesten Beispiele sind die Interferone und Interleukine. Eine weitere Möglichkeit besteht im Einsatz von monoklonalen Antikörpern. Dies sind kleine Eiweißmoleküle mit Abwehrfunktion, die spezifisch gegen bestimmte Oberflächenmerkmale auf Krebszellen (Tumorantigene) gerichtet sind. Dadurch werden Krebszellen entweder direkt angegriffen oder andere Zellen und Funktionen der Immunabwehr aktiviert. Sie können auch mit Zellgiften oder radioaktiven Stoffen gekoppelt werden, um dann wie "Lenkwaffen" diese Substanzen an die Krebszellen heranzubringen.

Die teilweise hohen Erwartungen, die in diese Verfahren gesetzt wurden, haben sich bisher allerdings nicht im gewünschten Umfang erfüllt. Neue Konzepte wie z.B. eine Kombination der verschiedenen Zytokine miteinander oder mit Chemotherapie, andere Dosierungen oder Anwendungsformen werden daher intensiv untersucht.

Bei aktiven immuntherapeutischen Verfahren versucht man, das körpereigene Immunsystem zur Bekämpfung des Tumors anzuregen. Durch Verabreichung von körperfremden Substanzen, die eine Abwehrreaktion auslösen, kann das Immunsystem unspezifisch oder ungezielt aktiviert werden. Man geht davon aus, daß durch die allgemeine Anregung auch die Abwehrreaktionen gegen den Tumor gesteigert werden, wobei diese Annahme bisher noch nicht bewiesen wurde. Zur Immunstimulation wurden schon verschiedene natürliche und synthetische Stoffe, Bakterienbestandteile und körperfremde Eiweiße eingesetzt. Die Behandlung mit Extrakten aus der Thymusdrüse und verschiedenen Pflanzeninhaltsstoffen beruht ebenfalls auf diesem Prinzip. Ob eine unspezifische Aktivierung des Immunsystems jedoch überhaupt Einfluß auf Krebserkrankungen hat, und wenn ja, ob einen positiven oder einen negativen, ist derzeit nicht ausreichend untersucht. Es mehren sich die Hinweise, daß ungünstige Effekte mindestens so wahrscheinlich sind wie günstige.

Aktive spezifische Immuntherapien sollen die körpereigene Abwehr zur gezielten Bekämpfung von Krebszellen anregen, indem den Abwehrzellen Merkmale des jeweiligen Tumors so präsentiert werden, daß sie diese Merkmale als fremd erkennen und solche Zellen, die diese Merkmale tragen, angreifen (Tumorimpfungen).

Was versteht man unter Tumorimpfungen?

Tumorimpfungen, fachsprachlich Vakzinetherapien, sind aktive Immuntherapien. Wie bei einer Impfung gegen Viren oder Bakterien bietet man dem Immunsystem ein oder mehrere tumorspezifische Merkmale (Antigene) an, um so eine gezielte und damit spezifische Immunreaktion gegen den Tumor auszulösen. Der Unterschied zu herkömmlichen Impfungen gegen Infektionserkrankungen besteht darin, daß nicht die Verhütung der Erkrankung, sondern die Aktivierung des Immunsystems zur besseren Bekämpfung einer schon bestehenden Erkrankung angestrebt wird.

Ein solches Verfahren wurde Mitte der 80er Jahre in klinischen Studien zuerst in den USA bei Darmkrebs und einer bestimmten Form von Hautkrebs, dem malignen Melanom, untersucht. Körpereigene Tumorzellen wurden durch Bestrahlung teilungsunfähig gemacht und mit einem Virus vermischt, um den Reiz für das Immunsystem zu erhöhen. Dieser "Cocktail" wurde in die Haut gespritzt mit dem Ziel, dort Abwehrzellen anzulocken und gezielt gegen Tumorzellen zu aktivieren. Mitte der 90er Jahre kam eine internationale Untersuchungskommission jedoch zu dem Schluß, daß die Wirksamkeit dieses Vorgehens trotz vieler Studien noch nicht ausreichend belegt sei.

In neueren Konzepten zur Tumorvakzination versucht man, nicht mehr ganze Zellen oder Zellbruchstücke zu verwenden, sondern spezielle, chemisch definierte Eiweißmoleküle, die von Tumorzellen produziert werden. Von diesen weiß man sicher, daß sie vom Immunsystem als fremd erkannt werden. Hierbei werden bestimmte Zellen, die sich aus Blutvorläuferzellen züchten lassen, im Reagenzglas mit diesen Merkmalen beladen. Gibt man sie so bestückt dem Patienten zurück, präsentieren sie den Abwehrzellen die Tumormerkmale ganz gezielt als etwas, was bekämpft werden muß. Einen ähnlichen Effekt hat es, wenn man in Krebszellen das Gen eines Lock- und Aktivierungsstoffes für Abwehrzellen einschleust und sie in den Körper zurückgibt. Beide Verfahren sind allerdings noch in der Entwicklung. Ob und bei welchen Krebsarten sie eine sinnvolle Ergänzung zu den bewährten Behandlungsmaßnahmen sein können, muß weiter untersucht werden.

Wie ist heute der Stellenwert der Immuntherapie in der Krebsbehandlung?

Die Immuntherapie ist noch eine vergleichsweise junge Disziplin. Das wachsende Wissen über die komplexen Wechselwirkungen zwischen Tumoren und der körpereigenener Abwehr und die modernen Techniken der Molekularbiologie könnten aber zur Entwicklung neuer und wirkungsvoller Strategien und Behandlungskonzepte führen. Bisher haben sich immuntherapeutische Verfahren nur bei einigen wenigen Krebserkrankungen als gleichwertige Alternative zu den herkömmlichen Behandlungsmethoden erwiesen. Insbesondere sind sie kaum in der Lage, große Tumoren zu zerstören, so daß ihre Anwendung wahrscheinlich in erster Linie bei kleinen Tumorresten nach Operation oder Strahlentherapie angebracht ist. Die sinnvolle Kombination verschiedener Immuntherapien oder von Immun- und Chemotherapie führt möglicherweise ein Stück weiter. Aber auch hier steht die Wissenschaft erst am Anfang. (Quelle: Krebsinformationsdienst des Deutschen Krebsforschungszetrums Heidelberg)

Ich arbeite zu Zeit als wissenschaftlicher Mitarbeiter im Immun- und Gentherapeutischen Labor von Prof. Dr. IGH Schmidt Wolf, Universitätsklinik Bonn. Die Ergebnisse, die hier beschrieben werden, sind im Rahmen meiner Doktorarbeit erstellt worden. Ich will hier die Konzepte der Gentherapie im weiteren konkretisieren und meine Arbeiten zu den Methoden des Gentransfers vorstellen. Als Biologe widme ich mich detailierter den molekularbiologischen Aspekten und Fragestellungen.

Schwerpunkte meiner Arbeit

Charakterisierung von Lymphomzellen.

Dabei finden etablierte Lymphom-Zellinien und Patientenmaterial Verwendung. Es werden Unterschiede der Expression von Oberflaechenantigenen, sowie die Expression diverser Tumor- und Tumorsuppressorgenen untersucht.

Transfektion von Zellen.

Die verschiedenen Zellen weisen oft Mutationen in bestimmten Genen auf. Bei den verwendeten Lymphomzellen ist meist eine Mutation im p53 Gen beschrieben (ca.60%). Ziel ist es eine effektive Technik und Vektoren einzusetzen, die nicht toxisch fuer die Zellen sind und eine starke Expression des Wildtyp-Gens erreichen. Zur Ueberpruefung eines effizienten Gentransfers wird meist ein Gen eingesetzt, welches leicht nachzuweisen ist. Hier werden meist Reportergene wie Beta-Galaktosidase oder Gruenes Fluoreszenz Protein (GFP) eingesetzt (Bilder dazu sind in der Galerie zu finden, auch naehere Erklaerung zu dem "Leuchtprotein"). Der Gentransfer in Lymphomzellen wurde von mir mit den gaengigen Transfektionsmethoden (Lipofektion, Elektroporation, Adenoviren) soweit ausgestet und fuer die Zellen optimiert, dass eine Transfektionseffiz von 50-100% bei den verschiedenen Zellen erreicht wurden.

Nachweis des Gentransfers.

Die Transfektionseffizienz des Reportergens wird durchflusszytometrisch oder im Fluoreszensmikroskop bestimmt. Die Expression der Expressionsvektoren (hier Wildtyp p53) wird auf RNA oder Proteinebene bestimmt. Nach erfolgreichen Gentransfer kommt die wichtigste Analyse. Welchen Einfluss hat die Expression des Wildtyps-Gens bei den Zellen die eine Mutation im p53 Gen haben? Hier wird nun die Proliferation, Sensibilitaet gegenueber immunologischen Effektorzellen und moegliche Veraenderungen bei der Expression von anderen Genen untersucht.

Methoden

Es finden hier fast alle gaengigen molekularbiologischen Methoden Verwendung (siehe auch Methoden-Link).

• Transformation von Bakterien, Herstellung Plasmid-DNA, Aufreinigung.
• Herstellung von Primaerkultur.
• Steriles Arbeiten mit Zellkultur (Einfrieren, Auftauen, Expansion von Zellen), Zytotox-Assays (LDH-Release).
• Durchflusszytometrie (FACS) und Anreicherung von Zellen (MACS).
• RT-PCR, Gelshifts, SDS-Page, Westernblots.
• Transfektionen mit liposomalen Transfektionsreagenzien (Superfect, Dosper, Dotap und weitere), Elektroporation.
• Arbeiten mit Adenoviren. Herstellung, Aufreinigung, Plaque-Assay, Transfektion / Infektion.

Sonstige Projekte

In unseren Labor der Universitaetsklinik Bonn haben auch Medizinstudenten die Moeglichkeit zur Anfertigung einer praktischen Doktorarbeit. In diesem Rahmen widme ich mich noch drei weiteren Projekten:

1. Untersuchung zur Expression von Killer Inhibitorischen Rezeptoren (KIR) auf der Oberflaeche von NK-aehnlichen Killerzellen (CIK).
2. Verminderung der Apoptose durch CD28 Antikoerper Inkubation.
3. Nichtvirale Transfektionstechniken zum Gentransfer in Leukämiezellen.

BBS (Beauftragter fuer biologische Sicherheit) bin ich noch nicht, aber fuer die Arbeiten der Sicherheitsstufe 2 in unserem Labor der Ansprechpartner. In erster Linie natuerlich zu Arbeiten mit Adenoviren. Fuer Hilfe bei Erstellung von Antraegen beim Landesumweltamt, stehe ich jederzeit zur Verfuegung. Bei den Molekularbiologischen Links verweise ich auch noch auf eine Onlineversion des Gentechnik Gesetzes.

Zusammenfassungen der aufgefuehrten Arbeiten sind in Vorbereitungen, koennen aber jeweils von den bereits veroeffentlichten Artikeln in der Medline abgerufen werden (Link zur Medline, siehe LINKS)

ausgewaehlte Posterpraesentationen und Vortraege:

Ergebnisse aus der Diplomarbeit in Köln, Arbeitsgruppe Prof. H. Tesch (Medizinische Klinik, Innere Medizin I) unter Anleitung von Prof. J. Howard (Institut fuer Genetik):

Das latente Membranprotein 1 des Epstein-Barr Virus aktiviert CD25 in Burkitt und Hodgkin Lymphomzellinien. Vockerodt M, Buttgereit P, Tesch H, Kube D. DGHO und ÖGHO, Frankfurt, 25-28.10. 1998.

Ergebnisse, die im Rahmen der Doktorarbeit in der Arbeitsgruppe Prof. IGH Schmidt-Wolf entstanden sind:

Adenoviral gene transfer of wild-type p53 inhibits growth of lymphoma cells expressing mutant p53. P Buttgereit, F Schakowski, A Märten, B Schoettker, K Brand, T Heinicke, IGH Schmidt-Wolf. (In Vorbereitung).

Efficient gene transfer into lymphoma cells using adenoviral vectors combined with lipofection. Buttgereit P, Weineck S, Röpke G, Märten A, Micka B, Schmidt-Wolf IGH. Onkologie, 22, suppl. 1:46, 1999.

Efficient gene transfer into lymphoma cells using adenoviral vectors. Buttgereit P, Weineck S, Röpke G, Märten A, Brand K, Heinicke T, Caselmann H, Huhn D, Schmidt-Wolf IGH. Blood 94(10), suppl.1, 408b, 1999.

Efficient gene transfer into lymphoma cells using adenoviral vectors combined with lipofection. Buttgereit P, Weineck S, Röpke G, Märten A, Brand K, Heinicke T, Caselmann H, Huhn D, Schmidt-Wolf IGH. DGHO und ÖGHO, Jena, 1999.

Effizienter Gentransfer in Lymphomzellen mittels adenoviraler Vektoren in Kombination mit Lipofektion. Buttgereit P, Weineck S, Röpke G, Märten A, Brand K, Heinicke T, Caselmann H, Huhn D, Schmidt-Wolf IGH. 3. Jahrestagung der Deutschen Arbeitsgemeinschaft für Gentherapie, Reisensburg, 1999.

Efficient gene transfer into lymphoma cells using adenoviral vectors. Buttgereit P, Weineck S, Röpke G, Märten A, Micka B, Schmidt-Wolf IGH, ASH-Meeting, New Orleans, 1999.

Adenoviral gene transfer of wild-type p53 inhibits growth of lymphoma cells expressing mutant p53. P Buttgereit, F Schakowski, A Märten, B Schoettker, K Brand, T Heinicke, IGH Schmidt-Wolf. DGHO und ÖGHO, Graz, 2000.

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